Essai d’applicabilité : Comment valider un test de stérilité pharmaceutique ?

On sait tous à quel point il est difficile et laborieux de valider un test de stérilité pour une méthode de microbiologie rapide.

Nous nous sommes alors demandé comment est validé un test de stérilité microbiologique avec la méthode compendiale (aussi appelée méthode traditionnelle).

Pour nous éclairer sur ce point, nous avons demandé à plusieurs SuperMicrobiologistes de nous expliquer comment se font les essais d’applicabilité (suitability tests) pour un test de stérilité microbiologique. 

Qu’est-ce qu’un test de stérilité compendial ?

Avant de rentrer dans le vif du sujet, revenons quelques secondes sur ce qu’est un test de stérilité microbiologique sur des produits pharmaceutiques.

Pour ce test de stérilité compendial, il existe deux méthodes :

Par filtration : Utilisée pour les produits… filtrables ! On filtre le produit, on rince (important pour éliminer les agents antimicrobiens), puis la membrane est recouverte d’un milieu de culture liquide (TSB : Trypticase Soy Broth  et FTM : Fluid Thioglycollate medium).

Par inoculation directe (direct inoculation) : Pour les produits non filtrables. On immerge le produit à tester dans un flacon contenant un milieu de culture liquide (TSB et FTM).

Dans les deux cas, on incube les bouillons minimum 14 jours, puis on vérifie s’il y a un trouble (signe d’une contamination) ou pas.

Les tests de stérilité sont décrits dans le chapitre 2.6.1 (Tests de stérilité) pour la pharmacopée européenne (Ph.Eur.), dans le chapitre  <71> (Sterility Tests) pour la pharmacopée américaine (USP), et la JP 4.06 de la pharmacopée japonaise (Sterility test)             

Qu’est-ce qu’un essai d’applicabilité?

Lorsqu’un nouveau produit pharmaceutique stérile est développé, avant de pouvoir faire un test de stérilité en routine, il est préférable de vérifier que la méthode qu’on va utiliser qu’on va utiliser permette de collecter/récupérer correctement les micro-organismes s’il y en a et donc potentiellement détecter une contamination lors du processus de fabrication du produit

Cela permet de vérifier si le produit a un impact (bien souvent inhibiteur) sur la croissance des microorganismes, ce qui pourrait compliquer la détection de potentiels contaminants… s’il y en a !

En gros, on cherche à vérifier qu’on n’aura pas de faux négatifs !

C’est pour cela qu’on procède à des tests d’applicabilité du protocole (également appelé suitability protocol ou applicability protocol en anglais).

Voici comment sont effectués les tests :

• On prépare 6 contrôles positifs (Produit + Germe) : Dans chacun des bouillons, on inocule une souche de la pharmacopée (<100 cfu).
  • Clostridium, Pseudomonas et Staphylococcus dans le thioglycolate (FTM).
  • Aspergillus, Bacillus, Candida dans le TSB.

Pour le test par filtration, l’ajout des microorganismes se fait dans la dernière solution de rinçage.

• On prépare des contrôles positifs mais cette fois-ci sans produits.
  
• Incubation des bouillons : Les bouillons sont incubés maximum 5 jours (et non 14 jours comme pour un test de stérilité compendial).
  
• Lecture visuel : Après incubation, on compare visuellement, pour chaque microorganisme, le contrôle positif avec produit et le contrôle positif sans produit. La croissance doit être “comparable”… bonjour la subjectivité !
  
• Vérification supplémentaire : On peut aller encore plus loin, en repiquant chacun des positifs, pour les identifier et donc vérifier qu’il s’agit bien de la souche inoculée et non d’un contaminant lors de la manipulation (ou provenant du produit).
  
• Répéter le protocole : Idéalement, il faudrait répéter ce protocole sur 3 lots différents de produits.

Si les croissances sont semblables, alors on considère que le produit n’a pas d’impact sur la croissance des microorganismes.

Que faire si les résultats d’essais d’applicabilité ne sont pas bons ?

En fonction des produits, il est possible que le protocole d’essai d’applicabilité ne fonctionne pas (croissance non similaire entre le contrôle positif( milieu + germe)  et le test (produit + milieu + germe)

Heureusement, dans ce cas, il existe des solutions alternatives. En voici quelques-unes :

Pour tests de stérilité par filtration :

• Augmenter le nombre de rinçages : Après filtration du produit, on peut effectuer jusqu’à 5x 100 ml de rinçages de la membrane.
  
• Utiliser des fluides de rinçage qui lèvent l’inhibition du produit. Il existe différents types de liquides de rinçage, avec plus ou moins de tween, ou de peptones… C’est presque un travail de chimiste là !

Pour les tests en inoculation directe :

• Augmenter le volume du bouillon.
  
• Inoculer le produit dans un fluide (type Fluide A), puis inoculer le fluide A + produit dans un bouillon… mais alors là, attention au volume du bouillon !

Il existe aussi des cas où le produit crée un trouble dans le bouillon après les 5 jours. Si, lors du test de suitability, on n’a pas laissé un contrôle produit négatif pendant 14 jours, on passe à côté de cette information… et là, c’est la catastrophe assurée lors du premier test de stérilité en routine !

Il existe des cas où le produit non contaminé crée un trouble dans le bouillon. Dans ce cas, comment différencier un produit contaminé d’un produit non contaminé ?

Heureusement il existe plusieurs solutions… Après 5 jours d’incubation, on prend 1 ml de bouillon + produit incubé que l’on met dans un nouveau bouillon (100 ml, 200 ml ou 600 ml). On re-incube 4 jours supplémentaires. S’il n’y a pas de trouble, c’est gagné !

S’il y a un trouble, alors la seule solution est d’étaler 100 µl de bouillon trouble après 14 jours d’incubation sur une boîte de TSA/SDA pour vérifier s’il y a une contamination.

Attention, pour ces deux dernières solutions, cela signifie que le test de stérilité va durer plus que les 14 jours de la méthode compendiale. 14 jours + 4 jours pour solution 1 et 14 jours + incubation du TSA/SDA (3 à 5 jours) pour la solution 2.

Quelles sont les limites des essais d’applicabilité ?

Le suitability protocol à l’avantage d’être relativement facile à mettre en place dans le laboratoire de microbiologie. La préparation des souches (qui peut être parfois laborieuse) pour la contamination artificielle des produits (<100cfu) n’est pas trop dure à préparer. Le nombre de réplicats n’est pas non plus trop important ( 6 souches sur 3 lots).

Il existe cependant quelques limites à ce test : 

• La LOD : Un test de stérilité permet de détecter 1 cfu alors qu’avec ce test on vise une contamination artificielle <100 cfu. On est donc largement au-dessus de la Limite de Detection (LOD) souhaitée.

• La subjectivité de la lecture : Pour être validé, le produit analysé doit avoir une contamination visuelle comparable au témoin positif. Même si les microbiologistes sont bien formé.e.s plusieurs d’entre elles.eux nous ont dit que c’était très subjectif et que parfois ils.elles avaient un doute.
  
• Les souches utilisées : Pour ce test, on utilise les 6 souches de la pharmacopée. Il n’y a donc pas d’obligation d’utiliser un slow grower (un microorganisme qui pousse lentement) ni même une souche endogène (un microorganisme qu’on retrouve régulièrement dans l’environnement de production).
  

Essais d’applicabilité et validation d’une RMM (Rapid Microbiology Method)

La question qu’on se pose est :

Est-il possible d’utiliser le protocole d’essai d’applicabilité pour la validation des méthodes rapides et alternatives ?

Cela pourrait permettre de valider plus facilement et rapidement ces méthodes, non ?

Dans un premier temps il faudrait prouver que la méthode alternative n’est pas inférieure à la méthode compendiale en testant des souches pures sans produits. Dans ce protocole on pourrait tester des LOD inférieures à 1.

Une fois cette partie de validation faite, on pourrait valider les produits grâce à des protocoles d’essai d’applicabilité.

Qu’en pensez-vous ?

On remercie tou.te.s les SuperMicrobiologistes qui nous ont aidé à l’écriture de cet article et plus particulièrement Sarah Sacoman.

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