Microbiologie pharmaceutique : L’importance des neutralisants dans les milieux de culture de suivi environnemental

Les neutralisants sont couramment utilisés dans les milieux de culture pharmaceutiques utilisés pour les contrôles environnementaux. En Europe, les TSA + Lécithine, Tween 80 (Polysorbate 80), Histidine et Thiosulfate sont considérés comme une référence pour la neutralisation. Cependant, la nature et les concentrations exactes des neutralisants ne sont pas mentionnées, ni dans l’EP (Pharmacopée Européenne) ni dans l’USP (Pharmacopée Américaine).

Cette expertise liée à la formulation des milieux de culture va donc fortement dépendre du fabricant de milieux prêts à l’emploi.

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Que dit la réglementation sur les neutralisants utilisés pour le monitoring environnemental ?

En ce qui concerne l’ajout de neutralisants, la Pharmacopée Européenne : EP 2.6.12 [1] (USP <61> aux États-Unis) en recommande certains. Le tableau « Common neutralizing agents for interfering substances » décrit les ingrédients actifs les plus couramment utilisés dans les désinfectants et leurs inactivateurs potentiels.

Le tableau ci-dessous représente les neutralisants recommandés à considérer selon le désinfectant utilisé :

Désinfectants / NeutralisantsSodium bisulfiteDilutionGlycineLécithineTweenThiosulfateMg2+, Ca2+
GlutaraldéhydesX      
MercuresX    X 
Phénols X     
Alcools X     
Aldéhydes XX  X 
Sorbate X     
QAC   XX  
Parabènes   XX  
Biguanides   X   
Iodine    X  
Halogènes     X 
EDTA      X
Tableau 1 : Agents neutralisants et substances interférents selon l’EP.

Le tableau 2.6-12-2 de l’EP ne donne aucune concentration de neutralisant à ajouter. Une indication des concentrations à utiliser pourrait provenir des fabricants de désinfectants, qui doivent fournir des données sur l’inactivation potentielle de leurs produits. Cependant, ces tests sont généralement effectués avec des concentrations de neutralisant qui ne s’appliquent pas aux milieux prêts à l’emploi. La concentration typique des neutralisants dans les milieux gélosés est la suivante : Lécithine (0,07 %) et Tween 80 (0,5 %), Histidine (0,05 à 0,1 %) et Na-Thiosulfate (0,005 à 0,05 %).

Alors que l’histidine et le thiosulfate de sodium sont des substances chimiques bien définies, le tween et la lécithine ne le sont pas. Leur origine biologique explique les variations de qualité, qui peuvent impacter significativement le pouvoir neutralisant des milieux de culture s’ils ne sont pas soigneusement vérifiés avant une utilisation en routine.

Le challenge de la neutralisation des ammoniums quaternaires

La formulation des désinfectants change également avec le temps. Les industriels innovent sans cesse pour proposer des produits toujours plus performants, challengeant la capacité des milieux de culture à neutraliser les résidus actifs. En conséquence, certaines formules ne sont plus totalement inactivées par TSA-LTHT.

Les exemples les plus récents en date sont la famille des ammonium quaternaires (QAC), actifs principalement contre les bactéries Gram positives.

Dans une étude récente [2], certaines formulations de QAC, aussi bien à faible qu’à forte concentration, n’ont pas été totalement neutralisées par LTHT. En prenant conscience de cela, les fabricants de milieux prêts à l’emploi ont proposé des milieux spécifiques, neutralisant mieux les désinfectants contenant des QAC que les TSA+LTHT standards.

Bien qu’il soit supposé que LTHT doit être utilisé, la liste fournie dans la Pharmacopée n’est qu’indicative. La présence de substances neutralisantes alternatives doit satisfaire à 2 critères comme indiqué dans EP 2.6.12 :

Neutralizing agents may be used to neutralize the activity of antimicrobial agents (Table 2.6.12.-2). They may be added to the chosen diluent or the medium preferably before sterilization. If used, their efficacy and their absence of toxicity for micro-organisms must be demonstrated [1].

 Ainsi, les laboratoires pharmaceutiques ont la liberté d’utiliser des neutralisants alternatifs, en restant conformes aux textes réglementaires à condition que l’absence de toxicité des neutralisants puisse être démontrée ainsi que leur efficacité contre les désinfectants utilisés.

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Une nouvelle génération de neutralisants efficace contre les ammoniums quaternaires

Le tableau ci-dessous propose un extrait d’une étude sur TSA-U+, répondant au besoin d’un neutralisant alternatif pour mieux inactiver certains des nouveaux désinfectants contenant des QAC.

Pour les résultats présentés ci-dessous, chaque boîte contact (TSA-LTHT et TSA-U+) a été inoculée avec une quantité de désinfectant représentant 20 ml/m². Après 15 min, des souches témoins ont été inoculées dans chaque boîte et incubées pendant 18-24h ou 3-5 jours respectivement pour les bactéries et les levures/moisissures.

Le taux de récupération (en %) pour TSA-LTHT et TSA-U+ a été calculé par rapport à des boîtes non traitées avec du désinfectant.

  

  TSA-LTHTTSA-LTHTTSA-LTHTTSA-U+TSA-U+TSA-U+TSA-U+TSA-U+TSA-U+TSA-U+
Désinfectant[QAC] mg/100 ml /[Biguanide]mg/100 ml S.aureus B.subtilis S.epidermidisS.aureus B.subtilisS.epidermidis E.coli P.aeruginosaC.albicansA.brasiliensis
Gigasept AF 4%876 /   00009276831169712399
Hexaquart forte 2%558 /   000086106799210197108
Klercide Quat/Biguanide500 / 200001111091261059511289
Amphospray 41IP109 / 9600087938985127127119
Tableau 2 : Extrait de l’étude de PMM sur l’effet de LTHT et U+ pour neutraliser les QAC [2] [3]

Dans les boîtes TSA-U+, le thiosulfate a été remplacé par du U+ comme neutralisant alternatif. U+ s’est avéré être un inactivateur très puissant des QAC et des biguanides, sans inhiber les micro-organismes, comme l’exige l’EP/USP.

Sur la même thématique : Comment choisir les températures d’incubation de vos milieux de culture ?

Conclusion : Toujours valider l’efficacité de la neutralisation

Dans tous les cas, chaque type de neutralisant, qu’il soit LTHT ou une autre formule, doit être validé avant utilisation. Il faudra utiliser les procédures de nettoyage du site (avec tous les désinfectants), en intégrant à la fois les souches de l’EP/USP et la flore environnementale pour refléter les conditions réelles d’utilisation. 

Article proposé en collaboration avec PMM (PHARMAMEDIA DR. MÜLLER)

A la lecture de cet article, si vous avez des objections ou des questions complémentaires, venez alimenter le débat en laissant un commentaire ci-dessous.

[1] European Pharmacopoeia V10.0, 2.6.12: Microbial Examination of Non-Sterile Products: Microbial Enumeration Tests

[2] Neutralisation von Desinfektionsmittelrückständen, Müller et al., Pharm. Ind. 79, Nr. 9, 1298–1302 (2017)

[3] U+, The New Standard For Environmental Monitoring

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