STEC : Retour d’expérience de la fromagerie Chabert sur la méthode Assurance GDS

Avant d’adopter une technologie dans son laboratoire de microbiologie alimentaire, il faudrait prendre le temps d’échanger avec d’autres utilisateurs, pour connaître les points forts et les faiblesses de la techno.

Notre mission chez SuperMicrobiologistes c’est de créer des passerelles entre les laboratoires de microbiologie alimentaire pour favoriser ce genre de retours d’expériences terrains.

Pour cet article,  nous avons eu la chance de pouvoir échanger avec Coralie Siebman, la coordinatrice du laboratoire de la Fromagerie Chabert, qui a mis en place la méthode PCR Assurance GDS de Merck pour la détection des E.coli producteur de shigatoxines (STEC) dans son laboratoire.

Voici son retour, sans concession !

En bleu : nous avons souhaité laisser la possibilité au fournisseur de la PCR Assurance GDS (Merck) de partager ses remarques et/ou commentaires.

Le CQ microbiologie de la Fromagerie Chabert

Coralie, pouvez-vous nous dire quelles sont les matrices analysées dans votre laboratoire ?

Nous analysons en interne tout un éventail de matrices à partir du lait cru en partant de la matière première (lait cru) jusqu’au produit fini (fromage après 3 jours de fabrication / fromage mi-affiné ou affiné). Nous analysons des fromages au lait cru type pâte pressée cuite (Emmental / Gruyère) et pâte pressée non cuite (Reblochon / Tomme de Savoie) ainsi que des fromages à pâte molle (Vacherin) .

Quel est le nombre d’analyses que vous faites par an ?

En terme de volume d’analyse, le laboratoire interne à la Fromagerie Chabert effectue plus de 50 000 analyses par an tous germes confondus. Historiquement le nombre d’analyses en Salmonelle et Listeria est plus important mais le nombre d’analyses STEC tend à augmenter d’année en année pour atteindre les 10 000 analyses STEC en 2022.

« La méthode Assurance GDS a attiré notre attention car elle utilise une séparation immunologique efficace (IMS) en amont de la PCR »

La détection des STEC par PCR

Depuis combien de temps utilisez-vous la méthode Assurance GDS de Merck ?

 Nous avons commencé à tester la méthode GDS en juin 2021 pour finalement mettre complètement en service cette méthode en janvier 2022. Nous avons donc à ce jour 2 années d’expériences sur la méthode GDS.

Avant d’utiliser Assurance GDS STEC, quelle méthode utilisiez-vous ?

Entre 2018 et 2021, nous utilisions une méthode PCR classique.

Pourquoi avez-vous changé de technologie ?

Le problème de la méthode initialement mise en place en 2018 était le grand nombre d’échantillons en suspicion et non confirmés (échantillons positifs présomptifs). Ces positifs présomptifs avaient un impact au quotidien sur la libération des lots :

• retard de libération des lots.
  
• perte de confiance de la production sur les résultats du laboratoire.
  
• Coût des analyses (confirmation) par un laboratoire externe incluant des faux positifs.
  
• Charge de travail supplémentaire pour poursuivre les analyses. 

Et pourquoi avoir choisi cette methode (Assurance GDS) ?

La méthode Assurance GDS a attiré notre attention car elle utilise une séparation immunologique efficace (IMS) en amont de la PCR capable de réduire ces présomptifs positifs et donc solutionner ces problèmes.

Quels kits utilisez-vous ?

 les Kits utilisés au laboratoire pour la détection des STEC comprennent :

• le test de 1ère intention pour la détection des gènes de virulence stx1 ou stx 2 + eae et du sérogroupe O157:H7 (kit MPX TOP 7)

• le test de 2ème intention pour la détection des sérogroupes non-O157 (qui incluent la détection des sérogroupes O26 / O103 / O121 / O111 / O45 / O145) (Kit MPX ID)

• le test de confirmation suite à la détection du sérogroupe O157:H7 (Kit EHEC ID pour E.coli O157:H7)

Pouvez-vous nous expliquer le déroulement du test ?

Tout commence par la pesée de 25 g d’échantillon (lait ou produit fini) mis en suspension dans 225 ml de milieu de culture mEHEC. Cette suspension est incubée à 41,5°C pendant 18 à 24h. 

Après incubation, nous procédons à l’immuno-séparation (IMS) : 1mL du bouillon de culture est mis en contact (pendant 10 min sous agitation) avec un volume précis de particules magnétiques spécifique à la capture des micro-organismes appartenant aux 7 sérogroupes O spécifiques des principaux STEC. 

Ces particules (mises en contact avec notre échantillon) sont ensuite récupérées suivant le principe de séparation immuno-magnétique (IMS) et incubées dans un bouillon cœur-cervelle (BHI) pour une durée de 2 à 4h (incubation dans le BHI spécifique au lait cru). Suite à cette incubation de 2 à 4h, les particules sont récupérées grâce à leur fonction magnétique et resuspendues dans 45ul de solution de resuspension. 

La PCR peut alors être lancée en transférant 30ul de cette solution de resuspension qui contient les particules magnétiques dans les tubes du kit MPX TOP 7 pour la détection des gènes stx et eae et du sérogroupes O157:H7.

En cas de positif (stx+/eae+), le kit de détection des sérogroupes (MPX ID) est alors lancé en repartant du bouillon de culture initial suivant le même principe de séparation immuno-magnétique. Lors de ce test pour le détection des sérogroupes, l’étape d’incubation dans le BHI n’est pas nécessaire même pour les produits issus du lait cru.

Et pour la confirmation, quel protocole utilisez-vous ?

 La confirmation des STEC est simplifiée avec la méthode GDS car celle-ci s’effectue directement à partir de l’immuno-capture ayant donné le résultat PCR (résultat PCR obtenu avec le kit MPX ID).

Le produit de l’immuno-capture est étalé sur des géloses chromogènes (Chromagar STEC + TBX pour les non-O157 et Chromagar STEC + CT-SMAC pour les O157 :H7).

Les colonies caractéristiques (5 colonies) sont ensuite testées en utilisant les kits précédemment citées en fonction du sérogroupe détecté (MPX TOP 7 + MPX ID pour les non-O157 et MPX TOP 7 + EHEC ID pour les O157 :H7). Si la colonie regroupe les gènes stx/eae + le sérogroupe alors l’échantillon est confirmé.

« La méthode GDS a considérablement réduit le nombre de positifs présomptifs (et non confirmés)… »

Avantages et limites de la technologie Assurance GDS

Quels sont pour vous les principaux avantages de la méthode Assurance GDS ?

La méthode GDS a considérablement réduit le nombre de positifs présomptifs (et non confirmés) et augmenté la réactivité du laboratoire pour la transmission des résultats nécessaire à la libération des lots. En effet, la méthode Assurance GDS nous a permis d’internaliser la confirmation.

Et quels sont les inconvénients de la méthode Assurance GDS ?

Seulement 36 échantillons peuvent être analysés simultanément sur un même thermocycleur pour l’analyse STEC ce qui limite le nombre d’analyses sur une journée. 

Réponse de Merck : Pour information, la méthode Assurance GDS propose la plupart des pathogènes avec 72 positions au lieu de 36. Le kit STEC 72 positions est en cours de développement.

Dans le cas des produits au lait cru, l’incubation dans le BHI retarde de 2h la transmission des résultats ce qui peut s’avérer problématique dans certains cas. Mais cette étape supplémentaire permet au final d’accroître la spécificité du résultat pour les matrices complexes comme les produits au lait cru., ce qui n’est pas négligeable.

Pour les autres tests du laboratoire (Salmo et Listeria), quelles méthodes utilisez-vous ?

Nous avons passé les analyses des Salmonelles sur la méthode GDS en même temps que les STEC. Pour la Listeria nous avons conservé la méthode en place depuis des années. Elle nous permet de détecter avec un seul kit la Listeria spp et la Listeria monocytogenes.

Merci beaucoup Coralie.

Si vous avez d’autres questions pour Coralie, n’hésitez pas à les poser en commentaire !

Si vous souhaitez parler à un.e spécialiste Merck de cette méthode, cliquez-ici. 

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