Microbiologie alimentaire : Tout savoir sur l’Eau Peptonée Tamponnée

L’EPT (Eau Peptonée Tamponnée) est un bouillon d’enrichissement (ou un diluant) utilisé dans la plupart des laboratoires de microbiologie alimentaire.

En commençant la rédaction de cet article, on se disait : “une EPT, c’est une EPT (elles se valent toutes !). En plus avec les certificats d’analyse des fournisseurs et les test de l’ISO 11133 il n’y a aucun risque ».

Il faut croire qu’on n’était pas les seul.e.s à penser ça :

Et bien on avait tout faux !

Au fil de nos rencontres, on s’est rendu compte à quel point ce n’était pas si simple que cela, et que le choix d’une EPT ne devait (surtout) pas être pris à la légère.

Il faut dire que l’EPT c’est LE point de départ de l’analyse. Si elle fonctionne mal, c’est toute l’analyse faite derrière qui peut-être en péril. On peut même avoir des risques de faux négatifs.

Dans cet article, nous avons rassemblé un maximum de pistes pour que vous puissiez choisir l’eau peptonée tamponnée la plus adaptée à vos matrices et à vos analyses.

Sommaire :

• Qu’est-ce que l’EPT
• Utilisation
• Les différents formats
• La composition
• Les critères de choix
• Les cas particuliers
• Conclusion

Qu’est-ce que l’Eau Peptonée Tamponnée

L’Eau Peptonée Tamponnée est un milieu de culture liquide (un bouillon) non sélectif qui permet de multiplier (enrichir) tous les microorganismes.

Utilisation de l’EPT

L’eau peptonée tamponnée est utilisée dans les laboratoires de microbiologie alimentaire pour la recherche de certains microorganismes, comme la Salmonelle.

En général on dilue 25 g de produit (matrice) à l’aide d’un diluteur gravimétrique dans 225 ml de bouillon d’enrichissement, l’EPT. Ce mélange est ensuite homogénéisé dans un broyeur pour extraire les microorganismes de la matrice. Puis incubé plusieurs heures dans un incubateur. Après incubation on prélève un échantillon pour en faire l’analyse avec une méthode de détection (milieu de culture, PCR ou autres).

L’eau peptonée tamponnée peut également être utilisée pour la détection des cronobacter sakazakii et l’énumération des listeria monocytogenes.

Elle peut aussi être utilisée comme diluant pour les dilutions en série.

Les différents formats d’Eau Peptonée Tamponnée

Aujourd’hui, les laboratoires de microbiologie alimentaires ont le choix entre plusieurs formats d’EPT : 

• La poudre : pour fabriquer soit même l’EPT, avec un auto-préparateur ou avec un autoclave
• Les poches prêtes à l’emploi (RTU ou PAE) : en 3 ou 5 litres stériles
• Les poches déshydratées : à préparer dans le laboratoire

Bien évidemment tous ces formats ont des avantages et des inconvénients, nous ferons bientôt un article sur le sujet.

Quelle est la composition de l’EPT

La composition de l’EPT est décrite dans plusieurs normes (ISO 11133 ou ISO 6887-1).

Composition pour 1 litre : 

Peptone : 10,00 g
Chlorure de sodium : 5,00 g
Phosphate disodique anhydre : 3,57 g
Phosphate monopotassique anhydre : 1,50 g
pH final 7,2 ± 0,2 à 25 °C

4 ingrédients, ça ne doit pas être bien compliqué. Et pourtant, si toutes les formules d’eau peptonée tamponnée étaient les mêmes, pourquoi auraient-elles toutes une couleur… différente ?

“ Vous pouvez suivre la même recette qu’un cuisinier étoilé… pas certain que votre plat soit aussi bon ! Pour la recette de l’EPT c’est pareil”

Marmiton

Toutes les personnes que nous avons interrogées (fournisseurs, auditeurs, microbiologistes) s’accordent à dire qu’il existe plusieurs variables dans la production de l’EPT : 

• La qualité et le choix des peptones.
• Le processus de fabrication.
• La vérification des performances des matières premières.

Ce n’est donc pas une légende, il existe bel et bien des différences de qualité entre les différentes EPT disponibles sur le marché. C’est aussi pour cela qu’il peut y avoir de grandes différences de prix.

Mais alors comment faire la différence entre une bonne EPT et une mauvaise EPT ?… Encore une question pour les chasseurs !

Les critères de choix pour l’EPT

Comme on vient de le voir, toutes les EPT ne se valent pas. D’ailleurs certains fournisseurs proposent deux références : 

• EPT de base
• EPT “améliorée”

Mais alors comment choisir ?

Votre choix va dépendre de plusieurs paramètres qui sont : 

• Vos matrices : sont-elles acides, acidifiantes ou alcalines ?
  
• Vos processus de production : est-ce que les souches vont être stressées ?
  
• Votre protocole : large pesée (375 g) ? ratio de dilution inférieur à 1/10e ?
  
• Vos méthodes de détection : temps d’enrichissement court ? Méthode de détection très sensible ?

Si vous avez répondu oui à certaines de ces questions, alors vous devez porter une attention particulière au choix de votre EPT. Une EPT de base ne sera peut-être pas suffisante.

Tester le pouvoir tampon du bouillon d’enrichissement

Certaines matrices peuvent être acides, acidifiantes (fromages, sauces, poudre de lait) ou alcalines.

Si le pouvoir tampon de l’EPT n’est pas bon, il y a un risque d’acidification ou de basification du bouillon. Par conséquent les souches ne seront pas dans les conditions optimales de croissance. Cela peut poser des problèmes pour des temps d’incubation courts et des méthodes de détection sensibles (risque de faux négatifs).

Test à faire : EPT + matrice → prise de pH (avant et après incubation)

Si le pouvoir tampon de votre eau peptonée tamponnée n’est pas suffisamment bon pour vos matrices, vous pouvez vous orienter vers des références d’EPT doublement tamponnées (voir ci-dessous).

Tester les performances de l’EPT

Pour vraiment challenger son EPT, on peut tester ces performances en suivant le protocole de l’ISO 16140-3. Cela permet de vérifier les performances du triptyque :

• Bouillon enrichissement
• Méthode de détection
• Matrice
  

Est-ce que cela signifie qu’il faut refaire une vérification à chaque changement de fournisseur d’EPT ?

Étant donné les différences de performances entre les EPT, la réponse est “idéalement oui”. Aie, on sait que ça ne va pas plaire à tout le monde !

Certificats d’analyses et ISO 11133

On entend souvent que l’EPT est “bonne” parce qu’on a un certificat d’analyse du fournisseur et qu’en plus on a vérifié les performances dans le labo avec l’ISO 11133.

Mais c’est 2 choses différentes. Le certificat d’analyse et l’ISO 11133 permettent de confirmer que le lot reçu est conforme.

Cela ne permet pas de confirmer que cette formulation d’EPT est performante avec vos matrices et vos méthodes de détection. Pour cela il faudrait le vérifier avec les protocoles de l’ISO16140-3.

Cas particuliers pour l’eau peptonée tamponnée

EPT + polysorbate 80

Si vous avez des matrices qui contiennent plus de 20% de matière grasse, vous devez utiliser de l’EPT qui contient du polysorbate 80 (Tween 80).

Cet agent émulsifiant et dispersant permet d’assurer que les microorganismes soient bien en contact avec le bouillon d’enrichissement.

EPT double concentration

La plupart du temps, lorsqu’on parle d’EPT double concentration, il s’agit en fait d’EPT doublement tamponnée. Qui va être particulièrement recommandée pour les matrices particulièrement acides ou alcalines.

Composition pour 1 litre : 

Peptone : 10,00 g
Chlorure de sodium : 5,00 g
Phosphate disodique anhydre : 7,14 g
Phosphate monopotassique anhydre : 1,50 g
pH final 7,2 ± 0,2 à 25 °C

Cependant la norme ISO 6887-1 indique que si la préparation de poudre contient déjà tous les ingrédients, il faut simplement doubler la quantité (dans ce cas on aura également le double de peptones et de chlorure de sodium).

EPT du fournisseur de la méthode alternative

La plupart des méthodes validées AFNOR ou Microval le sont avec des EPT non-propriétaires. Cela signifie que le labo peut utiliser l’EPT qu’il souhaite avec la méthode certifiée.

Pourtant lors des validations, chaque fournisseur utilise sa propre EPT. Les performances des EPT étant toutes différentes, il serait donc logique de privilégier la référence d’EPT utilisée lors de la validation de la méthode de détection.

Et puis en cas de problème, cela permet de raccourcir les temps d’investigations. Quand on a plusieurs méthodes alternatives, de plusieurs fournisseurs différents ça peut devenir compliqué !

Conclusion

Comme on vient de le voir, toutes les EPT ne se valent pas.

On ne peut malheureusement pas vous dire laquelle utiliser, puisque cela dépend de vos matrices et de vos méthodes de détections.

A vous donc de faire une analyse de risque et de la compléter éventuellement par quelques tests dans le laboratoire.

Parce que finalement à quoi ça sert d’avoir une Rolls Royce en détection, si on ne lui donne pas le bon … carburant ?!!

Références :

ISO 6887-1 Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique

ISO/TS 11133:2014. Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau – Préparation, production, stockage et essais de performance des milieux de culture.

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